Пцр диагностика что это такое при гепатите





ПЦР и гепатит

Чтобы вылечить заболевание, сначала его нужно правильно диагностировать. И чем быстрее и точнее будет поставлен диагноз, тем больше шансов на выздоровление.

Один из главных прорывов медицины в быстрой и точной диагностике инфекционных заболеваний был совершен 1983г, когда Кэрри Мюллис изобрел полимеразно-цепную реакцию (ПЦР), которая позволяет легко определить, какая инфекция вызвала заболевание. В случае гепатита, к примеру, ПЦР не только позволяет за считанные минуты узнать, какой тип вируса вызвал болезнь, но при помощи ПЦР можно определить, к каким лекарствам вирус устойчив, а какие смогут полностью уничтожить болезнь.

ПЦР, зачем она нужна?

До появления ПЦР существовал единственный способ получить генетический материал – вырастить живое существо, содержащее нужный ген. Открытие ПЦР позволило размножать , или как говорят биологи – амплифицировать необходимый ген без участия всего остального организма.

Еще сложнее было с определением того, содержит ли живой организм тот или иной ген, или нет. К примеру, одним из лучших лекарств против гепатита В считается ламивудин (Lamivudine). Однако некоторые штаммы вируса, вызывающего гепатит В обладают резистентностью к этому препарату.

Чтобы узнать методами классической вирусологии, поможет ли лавимудин конкретному пациенту, нужно взять образец крови больного, выделить из него чистый вирус, вырастить в куриных эмбрионах культуру вируса, снова очистить его, опять провести тест на куриных эмбрионах, уже с добавкой препарата, снова выделить вирус, определить его количество

Для проведения подобного исследования требовалось несколько месяцев работы целой лаборатории. К тому же, из-за опасностей работы с живыми вирусами, подобными исследованиями могли заниматься лишь специально оснащенные институты.

Все что оставалось врачам, это наугад подбирать препараты, пока один из них не помогал. Из-за этого уходило драгоценное время, а побочные эффекты от лекарств еще сильнее ослабляли печень.

Появление ПЦР позволило выявлять искомый ген за несколько часов, при помощи аппаратуры, которая вполне поместится на одном столе. К тому же, для проведения ПЦР нужен лишь соответствующий участок генома, поэтому можно деактивировать вирус, что существенно упрощает транспортировку инфекционного материала и работу с ним.

ПЦР, что это такое?

В самых общих чертах ПЦР выглядит следующим образом. В пробирку вносят генетический материал, который потенциально может содержать искомый ген, праймеры – химически синтезированные отрезки искомого гена небольшой длины, особый фермент: ДНК-полимеразу (или РНК полимеразу в случае некоторых вирусов гепатита), который способен выстроить цепочку нуклеиновой кислоты, полностью идентичную первоначальной и набор из 4 видов свободных нуклеотидов – строительного материала для ДНК или РНК, один из которых содержит радиоактивный фосфор.

Затем смесь нагревают до 94-96 С (при этой температуре две спирали ДНК, обычно плотно переплетенные между собою, расплетаются). Затем следует охлаждение. При этом праймеры прикрепляются к искомому участку генома, не давая ДНК (или РНК) вновь образовать двойную спираль. После этого полимераза находит свободную цепочку нуклеотидов. (Для работы этого фермента нужна одиночная цепочка нуклеотидов. Так как полимераза скользит по цепи ДНК, как блок по тросу, на двойных спиралях она работать не способна).

Затем следует повторный цикл нагрева, в результате чего цепочки нуклеотидов разделяются между собой.

При каждом цикле ПЦР количество искомого гена увеличивается в геометрической прогрессии, тогда как количество остального генетического материала растет линейно.

Очистив раствор от остатка нуклеотидов и разделив цепочки ДНК по молекулярной массе при помощи электрофореза, можно без проблем узнать, содержится ли искомый ген в образце, или нет.

Более того, определив уровень радиоактивного излучения, можно узнать, какое количество генетического материала содержалось в образце (в случае гепатитов – определить уровень вирусной нагрузки).

Еще одно достоинство ПЦР – очень высокая чувствительность реакции ПЦР, гораздо выше, чем при классических методах определения вирусов. В идеале, чтобы выявить искомый ген – для ПЦР нужен всего один вирус.

Кроме того, ПЦР полностью специфична – праймеры создают таким образом, чтобы они соответствовали уникальным участкам искомого гена, которых нет ни у какой другой последовательности (как у каждого человека существует уникальный отпечаток пальцев, так и у каждого гена есть участки с уникальной последовательностью нуклеотидов).

ПЦР и диагностика гепатитов

Сегодня известно по меньшей мере пять вирусов, которые способны поражать печень. Хотя по строению и происхождению эти вирусы существенно различаются, но они вызывают сходные клинические симптомы поражений печени. Поэтому их объединили в искусственную группу: вирусы гепатита А, В, С, D, Е.

Но, так как лечить надо не симптомы, а саму болезнь, а подходы к лечению разных типов вирусов, вызывающих гепатит, существенно различаются, одна из главных задач диагностики гепатита – это определение типа вируса, вызвавшего болезнь.

При помощи ПЦР это можно сделать в самом начале заболевания. Не дожидаясь симптомов, которые позволяют различать гепатиты по клинической картине.

ПЦР и гепатит А

ПЦР с успехом применяют для выявления носителей гепатита А в очагах инфекции (к примеру, если в детском саду заболело гепатитом А несколько детей). Непосредственно генетический материал вируса в крови можно выявить гораздо раньше появления антител, еще до начала заболевания.

ПЦР и гепатит В

ПЦР – это самый ранний способ выявления гепатита В. ДНК вируса появляется в крови на 20 дней раньше, чем так называемый австралийский антиген, по которому определяют гепатит В иммунологическими методами.

Кроме того, ПЦР позволяет выявить хронический бессимптомный гепатит и мониторить вирусную нагрузку у больных хроническим гепатитом В – то есть оценить эффективность лечения.

ПЦР и гепатит С

ПЦР при выявлении гепатита С просто неоценима! Этот тип гепатита часто протекает вообще без симптомов, но у 85% пациентов переходит в хроническую форму и приводит к циррозу печени. Поэтому ПЦР позволяет выявить вирус еще до того, как заболевание стало неизлечимым.

Также, ПЦР помогает выбрать наиболее эффективную схему противовирусного лечения и оценить ее результативность ее применения.

Тесты
Здравые решения

Современная диагностика гепатита В. Выявление HBsAg

Серологическая диагностика гепатита В в настоящее время строится на основании определения маркеров НВ-вирусной инфекции, как правило, с помощью имуноферментного анализа, то есть антигенов вируса гепатита В или антител к ним в биологических субстратах, главным образом, в сыворотке крови. В качестве основных маркеров гепатита В, имеющих самостоятельное значение для серологической диагностики, сегодня признаны:

HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В) — основной маркер, свидетельствующий о наличии вируса гепатита В. При остром гепатите В HBsAg можно обнаружить еще в продромальном периоде, и длительность его персистенции при неосложненном течении составляет до 10 недель;

HBeAg — показатель высокой степени активности инфекционного процесса. Маркер репликации HBeAg определяется, как правило, при наличии HBsAg, однако циркулирует в крови менее продолжительное время — в среднем 4 недели;

anti-HBc класса IgM — показатель острого инфекционного процесса или, при хронических формах гепатита В, косвенный показатель активной репликации HBV. Возможна их длительная циркуляция;

anti-HBc (суммарные) — так называемые «анамнестические» антитела, образующиеся в результате перенесенного гепатита В, также присутствуют при хроническом гепатите В в комплексе с другими маркерами. В ряде случаев отмечена пожизненная циркуляция;
anti-HBs — свидетельство перенесенной ранее инфекции или поствакцинального иммунитета:

anti-HBe — не являются показателем, характеризующим какое-либо конкретное состояние при гепатите В. Эти антитела могут быть и в конце острого гепатита В и при хроническом гепатите и в случаях, так называемого здорового носительства HBsAg.

Хронический гепатит В. в фазу обострения наблюдается следующий профиль маркеров: HBsAg, HBeAg, DNA HBV, anti-HBc IgM и суммарные. В период стихания процесса обнаруживаются HBsAg, anti-HBc IgG (суммарные), возможна сероконверсия HBeAg на anti-HBe.

В основе всей серологигеской диагностики гепатита В. как острых, так и хронигеских форм—лежит определение HBsAg. Современные иммуноферментные тест-системы позволяют выявлять HBsAg в концентрациях до 0,1 нг/мл. Схема определения у разных тест-систем, как правило, одна и та же. В качестве иммуносорбента используются антитела к HBsAg. Как правило, применяются моноклональные антитела.

Именно они обеспечивают строгую специфичность применяемых в настоящее время диагностических наборов.

Сравнительные исследования чувствительности зарегистрированных во Франции иммуноферментных тест-систем различных производителей, проведенные Французским обществом переливания крови, позволили определить, что лучшие показатели могут быть достигнуты в результате длительной ночной инкубации при комнатной температуре.

Соблюдение таких условий постановки позволило определять HBsAg в концентрации 0,08 нг/мл («Wellcozyme HBsAg», производства «Murex»). Необходимо отметить, что наличие или отсутствие отдельных маркеров HBV может быть обусловлено не только особенностями иммунной системы человека, но и инфицированием мутантным штаммом HBV. Существует значительное количество мутаций вируса, при которых могут отсутствовать маркеры, обязательные при инфицировании дикими штаммами HBV.

ПЦР (полимеразная цепная реакция) в диагностике гепатита В

Метод полимеразной цепной реакции используют для подтверждения НВ-вирусной инфекции, наличия репликации вируса при остром и хроническом гепатите В, а также определения эффективности курса лечения. Наибольшей чувствительностью обладает двойной нестед-метод, который предполагает использование двух пар праймеров. Чувствительность нестедметода весьма высока и позволяет выявлять несколько копий DNA HBV в образце, что существенно превосходит возможности ИФА.

Сегодня разработаны соответствующие технологии производства отечественные тест-системы для детекции DNA HBV с помощью ПЦР, которые активно применяются в практическом здравоохранении. Высокая чувствительность ПЦР-диагностики при гепатите В расширила возможности раннего определения вируса гепатита В при острой инфекции. Длительность инкубационного периода при гепатите В достигает 6 месяцев, а в ряде случаев и больше. В это время вирус попадает в кровь, проникает в клетки печени, запускается механизм репликации, и в результате размножение приобретает устойчивый характер.

Эти процессы не затрагивают в значительной степени жизнедеятельность печени и других органов в течение длительного времени. В этот период эффекторные реакции иммунной системы организма не задействованы. Число вирусных частиц резко возрастает к концу инкубационного периода и становятся максимальными. В этот период методом ПЦР можно обнаружить в крови вирус гепатита В, тогда как остальные маркеры НВ-вирусной инфекции, главным образом серологические, ещё отсутствуют. Таким образом, с помощью полимеразной цепной реакции стала возможной более ранняя диагностика острого гепатита В.

Источники: http://zdravoe.com/266/index.html, http://meduniver.com/Medical/zabolevania_pecheni/diagnostika_gepatita_b.html








Комментариев пока нет!

Поделитесь своим мнением